RNA逆转录实验中，如何判断RNA是否降解?

　　RNA逆转录实验中，如何判断RNA是否降解?RNA降解的检测方法

　　琼脂糖凝胶电泳‌

　　完整RNA‌：电泳后应显示清晰的28S和18S rRNA条带，28S亮度约为18S的2倍(28S:18S≈2:1)。

　　降解RNA‌：条带模糊、拖尾或比例异常(如28S亮度显著降低)，甚至出现低分子量弥散‌。

　　DNA污染‌：若加样孔附近出现荧光区带，提示可能存在DNA污染‌。

　　紫外分光光度法‌

　　纯度评估‌：OD260/OD280比值1.8-2.1为合格，低于1.8提示蛋白污染，高于2.1可能为RNA降解‌。

　　浓度计算‌：OD260值用于定量RNA浓度(1 OD≈40 μg/mL)‌。

　　生物分析仪(RIN值)‌

　　RIN值‌：通过微流体芯片评估RNA完整性，RIN≥7为高质量，RIN<5提示严重降解‌。

　　RNA降解的常见原因及预防

　　RNase污染‌：使用RNase-free耗材，操作时佩戴手套并喷RNase Zap‌。

　　样本处理不当‌：组织未及时裂解或反复冻融，需快速低温保存(-80℃)‌。

　　机械剪切力‌：避免剧烈涡旋或枪头吹打‌。

　　实验优化建议

　　预变性处理‌：65℃孵育5分钟可打开RNA二级结构，提高逆转录效率‌。

　　引物选择‌：Oligo dT引物适用于真核mRNA，随机引物适用于降解样本‌。

　　酶选择‌：高GC含量RNA建议使用耐高温逆转录酶‌。

　　若需进一步验证，可通过qPCR扩增内参基因确认cDNA质量‌。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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