使用大鼠ELISA试剂盒进行实验需遵循哪些操作流程

　　使用大鼠ELISA试剂盒进行实验需遵循哪些操作流程

　　大鼠ELISA试剂盒实验需遵循‌从样本准备到结果计算‌的标准化流程，全程操作可分为5个核心阶段，具体步骤如下：

　　一、实验前期准备

　　样本制备‌(根据不同样本类型处理)

　　血清‌：全血室温静置2小时或4℃过夜，1000×g离心20分钟，取上清检测;

　　血浆‌：推荐EDTA-Na₂抗凝，采集后30分钟内1000×g离心15分钟，取上清，避免溶血、高血脂样本;

　　组织匀浆‌：预冷PBS冲洗去血，称重剪碎后按1:9(g/mL)加PBS冰上研磨，超声破碎或反复冻融后，5000×g离心5~10分钟取上清;

　　所有样本1周内检测可4℃保存，长期需分装冻存于-20℃(1个月内)或-80℃(6个月内)，严禁反复冻融;浓度超标需提前稀释，建议预实验确定稀释倍数。

　　试剂平衡‌：天正信达试剂盒取出后室温放置30分钟，所有试剂恢复至室温后使用，剩余未用板条密封后2~8℃保存。

　　洗涤液配制‌：通常为20~30倍浓缩液，按说明书比例用蒸馏水稀释后备用。

　　二、加样与温育

　　分别设置‌空白孔‌(仅加样品稀释液，不加样本和酶标试剂)、‌标准品孔‌、‌待测样本孔‌;

　　标准品稀释：按说明书梯度稀释(一般为5个浓度梯度，例如12ng/L、8ng/L、4ng/L、2ng/L、1ng/L)，每孔加50~100μl稀释好的标准品;

　　待测样本孔：先加40μl样品稀释液，再加10μl待测样本(终稀释度为5倍)，加样时避免触碰孔壁，轻轻晃动混匀;

　　封板膜封板后，37℃温育30分钟(若为一步法试剂盒，温育时间延长至60分钟)。

　　三、洗涤与加酶

　　温育结束后揭掉封板膜，弃去孔内液体，每孔加满洗涤液静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍干;

　　除空白孔外，每孔加入50~100μl酶标试剂，再次封板，37℃温育30分钟。

　　四、显色与终止

　　重复洗涤步骤5次拍干后，每孔先加50μl显色剂A液，再加50μl显色剂B液，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10~15分钟(显色时间可根据颜色梯度适当调整);

　　显色完成后，每孔加50μl终止液，终止反应(此时蓝色会立即转为黄色)。

　　五、读数与结果计算

　　以空白孔调零，在终止反应后15分钟内，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度(OD值)，可搭配630nm参比波长校正误差;

　　以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标拟合标准曲线，根据样本吸光度计算浓度，最后乘以样本稀释倍数，得到最终检测结果。

　　注：以上科研产品资料供参考，具体可咨询技术老师!

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