ELISA实验| 操作材料仪器、步骤、注意事项、常见问题

　　ELISA实验| 操作材料仪器、步骤、注意事项、常见问题

　　ELISA实验材料与仪器

　　试剂‌：96孔酶标板、特异性包被抗体/抗原、HRP标记二抗、样本稀释液、PBST洗涤液、1% BSA封闭液、TMB显色液、终止液、梯度标准品

　　实验仪器‌：单/多道校准移液器、恒温培养箱、酶标仪、洗板机(或手工洗板耗材)、离心机、4℃/-20℃冰箱、pH计

　　辅助耗材‌：无酶枪头、封板膜、吸水纸、离心管、一次性手套

　　标准操作步骤(以双抗体夹心法为例)

　　包被封闭‌：用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释捕获抗体，每孔加100μL，4℃过夜包被;PBST洗3次后，每孔加150μL 1% BSA，37℃封闭1小时

　　样本孵育‌：弃封闭液洗3次，每孔加100μL梯度标准品/预处理样本，封板后37℃孵育1-2小时

　　洗板加酶标抗体‌：弃液洗3-5次拍干，每孔加100μL稀释后的酶标二抗，37℃避光孵育30-60分钟

　　显色终止‌：再次充分洗板拍干，每孔加100μL TMB底物，37℃避光显色10-15分钟;每孔加50μL终止液终止反应

　　读值分析‌：15分钟内用酶标仪在450nm波长下测定OD值，通过标准曲线计算样本中目标物浓度

　　关键操作注意事项

　　样本处理‌：血清避免溶血、细菌污染，短期4℃保存不超过5天，长期分装-20℃冻存，严禁反复冻融

　　试剂管控‌：所有试剂实验前室温平衡30分钟，不同批次试剂不可混用，显色液现配现用避免光照分解

　　操作细节‌：加样垂直加至孔底中央，避免触碰孔壁;洗板每孔注液≥300μL，浸泡30秒以上，拍干无残留

　　温育控制‌：严格把控37℃温育时间，酶标板加盖封板膜，避免液体蒸发，禁止叠放酶标板保证温度均匀

　　常见问题与解决方案

　　整板不显色/显色过浅‌：核对是否漏加酶标抗体/显色液，确认试剂盒未过期，适当延长孵育时间

　　背景过高/花板‌：增加洗板次数延长浸泡时间，更换被污染的底物试剂，提高封闭液浓度延长封闭时长

　　标准曲线拟合差‌：标准品避免反复冻融，提前校准移液器，梯度稀释时每步充分混匀

　　数据重复性差‌：同一实验单人操作避免加样误差，孵育时减少恒温箱开门次数，样本使用前充分涡旋混匀

　　注：以上科研产品资料供参考!

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